20140328藥典法新增—拉曼光譜法(三) 發(fā)布日期：2014-04-02 00:00:00 文章來源：萊雷科技
由于拉曼信號絕對強度的波動，使用內(nèi)標是最普通和有效的減少可變性的方法。內(nèi)標方
法有幾種變通選擇。可以有目的地加入一種內(nèi)標，該內(nèi)標應(yīng)具有與待測物互不干擾的獨特譜
帶以便檢測。在溶液中，也可利用溶劑的獨特譜帶，因為溶劑隨樣品不同將相對保持不變。
另外，在制劑中，如果賦形劑量大大超過待測組分，則可以使用該賦形劑的峰。在假設(shè)激光
和樣品定位的改變將會同等地影響全光譜的前提下，全光譜同樣可以用作參比。
樣品測定中需考慮的重要因素還有光譜的污染。拉曼是一種可以被許多外源影響掩蔽的
弱效應(yīng)。普通的污染源包括樣品支持物（容器或基質(zhì)）和周圍光線。通常，這些問題可以通
過細致的實驗方法來識別和解決。
儀器裝置
根據(jù)獲得光譜的方式，拉曼光譜儀可分為FT拉曼光譜儀和色散型拉曼光譜儀，但所有
的現(xiàn)代拉曼光譜儀均包括激光光源、樣品裝置、濾光器、單色器（或干涉儀）和檢測器等。
⑴ 激光光源
表1列出幾種在藥學(xué)應(yīng)用中經(jīng)常使用的激光。紫外激光有時也有特殊應(yīng)用，但是由于種
種原因在常規(guī)分析中很少采用。
⑵ 樣品裝置
可有各種各樣的樣品放置方式，包括直接的光學(xué)界面，顯微鏡，光纖探針（不接觸或光
學(xué)浸入）和樣品室（包括特殊的樣品盛器和自動樣品轉(zhuǎn)換器）。樣品光路也可設(shè)計成能獲得
偏振相關(guān)拉曼光譜，這種光譜通常包含附加信息。樣品裝置的選擇應(yīng)根據(jù)待測物的具體情況
（如樣品的狀態(tài)、體積等）以及測量的速度，激光的安全性和樣品圖譜的質(zhì)量要求等決定。
⑶ 濾光裝置
激光波長的散射光（瑞利光）要比拉曼信號強幾個數(shù)量級，必須在進入檢測器前濾除。
普遍采用的是陷波濾波器，它具有濾波效果好和體積小等優(yōu)點。另外，為防止樣品不被外輻
射源（如房間燈光、激光等離子體）照射，需要設(shè)置適宜的濾波器或者物理屏障。
⑷ 光波處理裝置
光波信號可通過色散或者干涉（傅里葉變換）來處理。任何合格儀器都適用于定性鑒別。
然而，選擇定量測定用儀器時，應(yīng)注意色散和線性響應(yīng)可能在整個波譜范圍內(nèi)并不均衡（例
如當使用階梯光柵分光鏡時）。
⑸ 檢測器
硅質(zhì)CCD是色散儀器中最常用的檢測器。這種冷卻的陣列檢測器允許在低噪聲下快速
全光譜掃描，常與通常使用的785納米二極管激光器配合使用。傅里葉變換儀器通常采用單
通道鍺或銦－鎵－砷化合物(InGaAs)檢測器以配合釹：釔－鋁－石榴紅(Nd:YAG)1064納米
的激光器在近紅區(qū)使用。
儀器校正
拉曼儀器的校準包括三個要素：初始波長（X軸）、激光波長以及強度（Y軸）。
儀器供應(yīng)商應(yīng)提供可由用戶可以執(zhí)行的對儀器相關(guān)參數(shù)校準的方法。除另有規(guī)定外，使
用者應(yīng)根據(jù)儀器所提供的校準方法制定具體的SOP，并嚴格按照SOP對上述參數(shù)進行驗證。
特別需要注意的是，激光波長變化可影響儀器的波長精度和光度（強度）精度。即使是
最穩(wěn)定的激光器，在使用過程中其輸出波長也會有輕微變化。所以，激光波長必須經(jīng)校正以
確保拉曼位移的準確性。可以使用儀器供應(yīng)商提供的拉曼位移標準參考物質(zhì)進行定期校正。
某些儀器可以用一種拉曼內(nèi)標物與初級光路分離，外在校準裝置通過散射輻射準確地重現(xiàn)這
一光路。
推薦使用外部參考標準對儀器進行校正。
方法驗證
必須對方法進行驗證，至少應(yīng)考察準確度、精密度等主要指標。但這些指標受諸多可變
因素的影響，其中熒光可能是影響方法適用性的主要因素。樣品中熒光雜質(zhì)的存在完全隨樣
品而異。所以，方法必須能適應(yīng)不同的樣品體系，必須足以將雜質(zhì)的影響降到最小。
檢測器的線性必須適應(yīng)可能的信號水平范圍。熒光可能使信號基線比驗證時高，這時必須設(shè)法將熒光減弱或者使驗證的方法適應(yīng)較高的熒光水平。這一要求對方法的精密度，檢測限（LOD）和定量限（LOQ）同樣適用，因為基線噪聲的增加會對這些數(shù)值產(chǎn)生影響。由于熒光使基線漂移可能同樣會影響定量，所以使用時，同樣需要在不同的光漂白作用水平進行可接受的定量驗證。
必須確定激光是否對樣品造成影響。在不同激光功率和暴露時間的條件下，對樣品目視
檢查和仔細審視測得的拉曼光譜可以確定樣品是否改變（而不是光漂白作用）。觀察的依據(jù)
是譜帶位置、峰強和譜帶寬度是否改變或者背景強度是否有明顯變化。
影響方法精密度的因素還包括樣品的位置和固體、液體樣品的形態(tài)，在校正模型中必須
嚴密控制或說明。樣品的制備方法或樣品試架的形狀可能影響測量靈敏度，而且，該靈敏度
會隨著儀器的激發(fā)光和采集光學(xué)設(shè)置的不同而不同。
測定法
測定拉曼光譜可以采用以下任一物質(zhì)態(tài)：結(jié)晶態(tài)、無定型、液體、氣體或等離子體。
液體能夠在玻璃管或石英管中直接測量。無定型和微晶固體也可充填入玻璃管或石英管中直接測定。為了獲得較大的拉曼散射光強度，通常使照射在樣品上的入射光與所檢測的拉曼散射光之間的夾角為0o，90o和180o。樣品池的放置可有多種方式。
除另有規(guī)定外，一般用作鑒別的樣品不必制樣，用作晶型、異構(gòu)體限度檢查或含量測定
時，供試品的制備和具體測定方法可按正文中各品種項下有關(guān)規(guī)定操作。
某些特殊樣品技術(shù)可被應(yīng)用于表面增強拉曼光譜和顯微拉曼光譜測量。
為防止樣品分解，常采用的辦法是旋轉(zhuǎn)技術(shù)。利用特殊的裝置使激光光束的焦點和樣品
的表面做相對運動，從而避免了樣品的局部過熱現(xiàn)象。樣品旋轉(zhuǎn)技術(shù)除能防止樣品分解外，
還能提高分析的靈敏度。
常采用內(nèi)標法定量，在激光照射下，加入的內(nèi)標也產(chǎn)生拉曼光譜，選擇其一條拉曼譜帶
作為標準，將樣品的拉曼譜帶強度與內(nèi)標譜帶的強度進行比較(通常比較譜帶的面積或高
度)。由于內(nèi)標和樣品完全處于相同的實驗條件下，一些影響因素可以相互抵消。
所選擇的內(nèi)標應(yīng)滿足以下要求：
①化學(xué)性質(zhì)比較穩(wěn)定，不與樣品中被測成分或其它成分發(fā)生化學(xué)反應(yīng)， ②內(nèi)標拉曼譜
帶和待測物的拉曼譜帶互不干擾， ③內(nèi)標應(yīng)比較純，不含有被測成分或其他干擾成分。對
于非水溶液，常用的內(nèi)標為四氯化碳(11475px-1)；而對于水溶液，常用的內(nèi)標是硝酸根離子
(26250px-1)和高氯酸根離子。對于固體樣品，有時選擇樣品中某一拉曼譜帶作為自身對照內(nèi)
標譜帶。
具有多晶現(xiàn)象的固體藥品，由于晶型不同，可能導(dǎo)致所收集的供試品光譜圖與對照品光譜圖或標準光譜集所收載的光譜圖不一致，遇此情況，應(yīng)按該品種項下規(guī)定的方法進行預(yù)處
理后再繪制比對。
光譜的形狀與所用的儀器型號和性能、激發(fā)波長、樣品測定狀態(tài)及吸水程度等因素相關(guān)。
因此，進行光譜比對時，應(yīng)考慮各種因素可能造成的影響。
起草單位：江蘇省食品藥品檢驗所
審校：江蘇省食品藥品檢驗所 王玉
復(fù)審：中國藥科大學(xué) 張尊建
